داستان بازی بلافاصله بعد از بازی اول اتفاق می افتد. Desmond Miles که از نسل قاتلانی مانند الطیر است توسط یک شرکت مرموز اسیر شده است و برای اهداف نامعلومی از DNA او استفاده می شود. این بار ۳۰۰ سال بعد از الطیر، فردی به نام Ezio Auditore Da Firenze (اتزیو آدیتوره دا فرینزه) مد نظر است که در قرن پانزدهم و در شهر ونیز زندگی می کند. او یکی از نجیب زادگان و اشراف ونیز است که به دلایل شخصی و انتقام جویی به فرقه ی قاتلین پیوسته است و قبل از این که وارد این گروه بشود، به بسیاری از فنون رزمی آگاهی داشته است. مهم ترین فرق اتزیو با الطیر این است که اتزیو علاوه بر این که یک قاتل است، یک تاجر هم هست و علاوه بر این، اتزیو از کمک یکی از افسانه ای ترین دانشمندان تاریخ یعنی لئوناردو داوینچی برخوردار است.